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技术服务

蛋白表达(哺乳动物细胞表达系统)

发布日期:2013-11-1 14:19:06,浏览次数:0

服务内容
1 目标基因全基因合成:
(1) 从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
(2) 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子,mRNA二级结构等的优化。
(3) 合成设计好的基因序列。

2 目标基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体
(1) 扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
(2) 将目标基因亚克隆到真核表达载体上。
(3) 测序验证构建质粒的准确性。
(4) 通过中抽获得重组的质粒DNA

3 小量转染并通过Western-blot检测表达:
(1) 利用转染试剂将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。
(2) 从转染后24到72小时,每12小时取样,通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。
(3) 可提供表达细胞株:293,293T,NIH/3T3,COS-7,CHO。

4 目标蛋白表达及纯化:
(1) 培养500ml哺乳动物细胞,然后将重组质粒转染到细胞中,通过瞬时表达产生目标蛋白。
(2) 收集含有目标蛋白的部分(细胞或培养上清)。
(3) 通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
(4) 通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
(5) 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

5 目标蛋白的再加工及详细检测:
(1) 内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
(2) 通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

6 筛选稳定高表达细胞株:
(1) 将转染后的哺乳动物细胞团转到96孔细胞培养板内,然后加入含有MTX的培养基。
(2) 当细胞长到大约2/3孔时,取培养上清检测表达。
(3) 挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选,并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。
(4) 重复加压筛选过程,提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。
(5) 通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。
(6) 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

7 大规模制备:
按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。

提供结果
1 目的基因(在T载体或常规穿梭载体上)及测序报告。
2 正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
3 目标蛋白表达结果。
4 纯化好的目标蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。
5 加工后的终产品及相关实验和检测报告。
6 稳定的高表达细胞株及筛选报告。
7 合格的目标蛋白及服务报告。

 

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