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技术服务

蛋白表达(毕赤酵母(P. pastoris)表达系统)

发布日期:2013-11-1 14:18:53,浏览次数:0

服务内容
1 目标基因全基因合成:
(1) 从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
(2) 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子,mRNA二级结构等的优化。
(3) 合成设计好的基因序列。

2 目标基因亚克隆:
(1) 扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
(2) 将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
(3) 测序验证构建质粒的准确性。
(4) 可提供表达载体:pPICZα和pPIC9K和pGAPCZα。

3 P. pastoris表达菌株电转化:
(1) 酶切线性化表达质粒。
(2) 将表达质粒通过电转化到高效的P.pastoris表达菌株中。
(3) 通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
(4) 可提供表达菌株:X33,GS115,KM71和SMD1168。

4 P. pastoris 表达菌株筛选:
(1) 将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增,然后换至BMMY培养基中,并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
(2) SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达
(3) 如果培养上清中检测不到表达,则通过将上清浓缩20倍作用再检测,或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达(客户需要提供相关抗体)。

5 P. pastoris表达菌株表达优化:
(1) 挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选,并对其中表达最好菌株优化表达条件。
(2) 对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目标蛋白的表达量。

6 目标蛋白表达及纯化:
(1) 摇瓶培养1L重组酵母菌,诱导表达目标蛋白。
(2) 通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
(3) 通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
(4) 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

7 目标蛋白的再加工及详细检测:
(1) 内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
(2) 通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。

8 大规模制备:
按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。

提供结果
1 目的基因(在T载体或常规穿梭载体上)及测序报告。
2 正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
3 PCR阳性克隆及PCR结果报告
4 阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
5 三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。
6 纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或 切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。
7 加工后的终产品及相关实验和检测报告。
8 合格的目标蛋白及服务报告。
 

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